一、RNA-seq测序流程步骤
RNA-seq测序是一种高通量测序技术，用于研究RNA分子的表达和转录组学。通常步骤如下：
1、RNA提取：提取样本中的RNA，可以使用化学方法或者机械方法。
2、RNA处理：将RNA进行净化，去除DNA、蛋白、RNA降解产物等杂质。
3、RNA测序库制备：将RNA经过聚合酶逆转录为cDNA，然后加入标签，通过PCR扩增得到文库。
4、高通量测序：将文库进行高通量测序，通常使用Illumina测序平台。
5、数据分析：将测序得到的reads对应到参考基因组上，进行定量和差异表达分析。
二、RNA-seq测序结果分析
RNA-seq测序结果分析包括如下方面：
1、质量评估：检查测序数据的质量和质量值分布。
2、去除连接序列和低质量序列：对测序数据进行过滤和修剪，去除连接序列和低质量序列。
3、比对：使用比对工具将测序reads比对到参考基因组，得到SAM/BAM格式的比对结果。
4、定量：使用基因定量工具通过比对结果统计基因和转录本的表达量。
5、差异分析：比较两组RNA-seq测序的表达数据，分析差异表达基因或转录本，对比分析得出某种转录本或基因在不同条件下的表达差异情况。
三、RNA测序的目的
RNA测序的主要目的是探究生物体转录过程的全景图，探究转录组学的therpeutic target。
常见的RNA-seq测序目的：
1、发现新的基因和转录本：RNA-seq技术可以发现不同细胞和组织中的新基因和转录本，促进基因组学和转录组学的发展。
2、表达量分析：RNA-seq数据可以量化基因和转录本的表达，全面展现基因和转录本在对应细胞和组织中的表达水平。
3、差异表达分析：RNA-seq数据差异分析可以发现不同基因和转录本在不同条件下的表达变化，为理解生物体发育、生理和病理状态提供线索。
4、功能注释: RNA-seq的分析可以进行基因和转录本的功能注释，预测在生理、生化和进化等方面的重要性。
四、如何确定RNA-seq的测序深度
RNA-seq测序深度是指测序产出的总reads数目，决定了RNA-seq测序的覆盖度和检测的基因数量。
一般情况下，RNA-seq测序深度建议至少20M reads，对于复杂生物系统或者复杂样品，建议使用更高的深度。
#RNA-seq测序深度计算 #R表示基因组大小或转录组大小 #C表示覆盖度 #D表示可靠的表达值，根据实验条件而定，一般为FPKM值 深度reads = （R * C * 2）/ D
五、转录组测序和RNA-seq的区别
转录组测序是一种方法，分析使用以获得抽样样品中特定组织的所有mRNA分子的那部分信息，该方法产生所有mRNA分子的序列，可以揭示胞内基因转录活性的总体状态，包括信使RNA的浓度和功能区域翻译后的潜在重组功能。
RNA-seq技术是目前分析基因表达的首选方法，与之前的基因表达分析方法相比，RNA-seq技术可以帮助研究者分析不同细胞或组织中的基因表达量差异，也可以用于鉴定基因的差异剪接，SNPs检测，表达调控研究，外显子和内含子的鉴别性表达分析等。
