差异表达分析（Differential Expression Analysis, DEA）是转录组数据研究中的常见任务之一，旨在比较不同条件下基因表达水平的差异。这种分析有助于我们确定与特定生物学过程相关的基因，了解在不同条件下基因表达的变化情况，探索潜在的生物标志物，以及预测疾病机制和药物作用靶点等。
一、差异表达分析的基本流程
1、数据清洗与预处理。
转录组数据往往存在各种误差，如测序质量低，接头污染等，需要进行一系列的数据清洗与预处理，例如去除低质量序列和接头序列，剔除低表达基因和异常样本等。
2、基因表达量计算。
通过比对、组装或直接计数等方法，计算每个基因在每个样本中的表达量，常用的计数方法包括FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）和TPM（Transcripts Per Million）等。
3、基因表达差异分析。
根据不同条件下的表达量矩阵，应用不同的统计方法进行基因表达差异分析，常用的方法包括t检验、方差分析、秩和检验、负二项分布模型（Negative Binomial distribution）等。
4、功能富集分析。
将差异表达分析得到的基因列表与生物学数据库进行比较，分析差异表达基因的生物学功能和通路，以便深入了解不同条件下生物学过程的变化。
二、差异表达分析的常见方法
1、RNA-seq。
RNA序列技术是目前最常用的差异表达分析技术，通过高通量测序仪对RNA样本进行测序，可以鉴定不同条件下基因表达的显著差异。RNA-seq技术在样本数量和表达量检测范围上都具有优势。
2、微阵列。
微阵列技术是早期差异表达分析的主流方法，利用基因芯片对RNA样本进行杂交检测，可以在同一试验中同时检测大量基因，并且一些商业芯片能够实现高通量检测。
3、北方印迹。
北方印迹技术是一种常规的差异表达分析方法，利用核酸探针对RNA样品中感兴趣的基因进行杂交检测，通过不同条件下RNA的表达量变化来评估基因表达的差异。
4、RT-qPCR。
RT-qPCR技术可用于检测少量RNA，具有快速、灵敏、准确和可重复性强等优点。它可以用于验证差异表达结果，是RNA-seq的重要补充。
三、代码实现
以下使用Python中的DESeq2库来实现差异表达分析。首先我们需要从FASTQ文件中获取原始序列，并进行比对、组装、计数等预处理工作。然后我们可以使用DESeq2库来进行基因表达差异分析：
'''
DESeq2库的使用步骤:
1、安装DESeq2：pip install DESeq2
2、读取表达量数据，不同行表示不同样本，不同列表示不同基因，本文使用的是TPM作为表达量，用pandas库读取数据为DataFrame；
3、将DataFrame转换为DESeqDataSet；
4、使用DESeq函数进行差异分析，得到DESeqResults对象，包括基因ID，基因名称，基因表达量以及差异表达分析的结果，例如FDR调整后的p值和log2比值等；
5、使用results函数将DESeqResults对象从数据框中提取出来，进行后续统计分析或可视化分析。
'''
import pandas as pd
from rpy2.robjects.packages import importr
from rpy2.robjects import r, pandas2ri
# 读取表达量数据
data_df = pd.read_csv("expression_matrix.csv", index_col=0)
# 将DataFrame转换为DESeqDataSet
pandas2ri.activate()
deseq2 = importr("DESeq2")
count_data = r['as.matrix'](data_df)
rownames = list(data_df.index)
colnames = list(data_df.columns)
dds = deseq2.DESeqDataSetFromMatrix(countData=count_data, colData=data_df, design=~condition)
# 使用DESeq函数进行差异分析
dds = deseq2.DESeq(dds)
res = deseq2.results(dds)
# 提取出差异表达分析的结果
results = pd.DataFrame(pandas2ri.ri2py(res))
四、总结
差异表达分析是转录组数据研究中的重要任务之一，可以帮助我们深入了解生物学过程的变化，以及探索潜在的生物标志物。RNA-seq技术是目前最常用的差异表达分析技术，同时也有微阵列、北方印迹和RT-qPCR等方法。Python中的DESeq2库可以帮助我们进行基因表达差异分析，得到FDR调整后的p值和log2比值等结果，为后续统计分析和可视化分析提供重要数据。
