一、RNA-Seq分析
RNA-Seq是基于第二代高通量测序技术的一种新的转录组测序技术，用于定性和定量研究转录组及其表达变化。与传统低通量测序技术相比，RNA-Seq有较高的覆盖度和灵敏度，可以检测到所有转录本，并能够检测到新的转录本。
RNA-Seq可以对mRNA、ncRNA、小RNA等不同类型的RNA进行定量分析，可以帮助人们在转录组水平理解基因调控和表达变化等过程。
# RNA-Seq分析代码示例 ## 定量分析 quantification <- quantTrimmed(ids, gtf, fa, inputDir, outputDir, 'paired-end') ## 差异分析 DEgenes <- diffAnalysis(quantification, outputDir, treat, ctl)
二、几种RNA-Seq建库方法
RNA-Seq建库方法包括两种：一种是基于全长转录本的建库方法（Full-length Transcript Sequencing，FTS）,另一种是基于短序列的建库方法（short read sequencing），也称为RNA-Seq。FTS的建库方法有：SMARTer、TAKARA等，这种建库方法可以区分多个转录本，并且可以轻易的发现独特的内部外显子；RNA-Seq的方法则是利用碱基突变监测RNA上的转录本表达。
# 几种RNA-Seq建库方法示例代码 ## SMARTer建库 building <- SMARTer(gene, fa) ## TAKARA建库 building <- takara(gene, fa) ## 碱基突变监测RNA上的转录本表达 ReadCov <- RNA_seq(Illumina_Reads, Genome, gene_annot)
三、RNA-Seq流程
RNA-Seq流程包括几个步骤：首先是RNA提取，获得RNA样本；然后是RNA破碎，将RNA打碎，得到RNA片段；接着是文库构建，将RNA片段转化成能够测序的文库；最后是高通量测序，将文库进行测序，并得到原始测序数据。
从原始测序数据的清洗、比对、计数和差异表达基因分析，再到富集分析等应用，RNA-Seq分析已经成为基因表达调控研究的常用分析方法，如差异基因表达、可变剪接等。
# RNA-Seq流程示例代码 ## RNA提取 RNA_extract <- RNA_Extract(tissuesamples) ## RNA破碎 RNA_fragmentation <- RNA_fragmentation(RNA_extract) ## 文库构建 library_create <- library_create(RNA_fragmentation) ## 高通量测序 high_throughput_seq <- high_throughput_seq(library_create) ## 比对 alignment<-Hisat2(genome_index,reads,alignment) ## 计数 Counts<-Featurecount(Genome, gtf, alignment, outdir) ## 差异表达基因分析 diffGene<-DESeq2(Counts, treatment, outputDir)
四、RNAse清除剂
RNA分子极为活泼，容易在样本采集或提取、处理过程中受到污染和降解。RNAse清除剂可以去除或抑制RNAse的活性，防止RNA的降解和样品的污染。
RNAse清除剂通常需要添加到RNA提取试剂中或直接加入样本中进行保护。使用RNAse清除剂可以保证RNA的完整性和稳定性，提高RNA-Seq实验的可靠性和准确性。
# RNAse清除剂示例代码 ## 添加到RNA提取试剂中 RNA_extract_add_RNAseClear <- Add_RNAseClear(RNA_extract) ## 直接加入样本中进行保护 direct_add_RNAseClear <- Add_RNAseClear(Samples)
五、RNA-Seq样本要求
RNA-Seq实验需要高质量的RNA样本，常用的RNA提取样本包括组织、细胞、血液等，在实验前需要准确地了解样本的来源、处理方法、存储方式等信息。
为了保证RNA-Seq的成功和可靠性，样本的DNA和RNA的质量需要在实验前进行检测和评估。常见的检测方法有琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop检测。
# RNA-Seq样本要求示例代码 ## 样本来源 tissue_sample <- Sample_from_tissue(tissue) ## 样本的处理方法和存储方式 Sample_Processing_and_Storage <- Processing_and_Storage(sample) ## 样本质量检测和评估 Sample_quality_monitoring <- Quality_Monitoring(RNA_Sample)
六、RNA-Seq测序价格
随着高通量测序技术的不断发展，RNA-Seq的价格也在不断下降。RNA-Seq测序价格的主要影响因素包括样本数量、文库制备方式、数据量等。一般情况下，RNA-Seq的实验费用在1万-6万之间。
# RNA-Seq测序价格示例代码 ## 根据样本数量计算费用 total_price <- Sample_num * price_per_sample ## 根据文库制备方式计算费用 total_price <- Library_build * price_of_library ## 根据数据量计算费用 total_price <- Data_Size * price_of_Data
七、RNA-Seq数据分析
RNA-Seq数据分析包括数据质控、比对、计数、归一化、差异基因分析等步骤。数据质控是RNA-Seq的重要步骤，可以帮助人们判断样本的质量和RNA提取的完整性。比对可以将原始测序数据映射到基因组或转录本组上，计数可以得到每个基因的表达量。归一化可以消除测序深度和样本之间基因表达量的差异，差异基因分析可以筛选出在不同条件下表达量有显著差异的基因。
# RNA-Seq数据分析示例代码 ## 数据质控 QC_Data <- FastQC(RawData) ## 比对 Alignment <- HISAT2(RawData, Index) ## 计数 Counting <- FeatureCounts(Alignment, GTF) ## 归一化 Normalization <- DESeq2(Counting, group) ## 差异基因分析 DEanalysis <- DESeq2(Normalization, batch)
八、RNA的全称
RNA的英文全称是Ribonucleic acid，中文名称是核糖核酸。
九、RNA-Seq和qPCR区别
RNA-Seq和qPCR（quantitative PCR）是两种基因表达分析方法。qPCR是一种定量分析方法，可以精确测定单个转录本的表达量，通过引物扩增来分析靶基因的表达数量。RNA-Seq技术可以分析基因整个转录本的表达水平和转录复杂性，并可以检测新的转录本，但无法精确定量单个转录本的表达量。
# qPCR的代码示例
## 引物设计
Forward_Primer = 'ATGAGATTACATAAGCAGAAGCTG'
Reverse_Primer = 'TTACAAGAGAGCAGCAGTGGTT'
qPCR_Probe = 'AACTGATAAACTTAGAGGTCATCCCACAAATCG'
##q-PCR
qPCR=quantitative_PCR(Template, Forward_Primer, Reverse_Primer, qPCR_Probe)
十、RNA前体选取
RNA前体选取技术（RNA-Protein Interaction Profiling）是一种在转录组水平研究mRNA、ncRNA和蛋白质间相互作用的方法。RNA前体选取技术可以很好地研究RNA相互作用蛋白质的特征，如结合位点和结合特异性等。
# RNA前体选取示例代码 ## RNA前体选取文库构建 Library_Construction <- RNA_Pro_Profiling(RNA_sample) ## RNA前体选取测序 RNA_Profiling_Seq <- RNA_Profiling_Seq(Library_Construction) ## RNA前体选取分析 RNA_Profiling_Analysis <- RNA_Profiling_Analysis(RNA_Profiling_Seq)
