一、什么是HTSeq-count
HTSeq-count是一个Python脚本，用于从SAM/BAM文件中计算每个基因对应的读数，并将计数输出到各自的基因区间中，以便进行下游分析，如差异表达分析和基因表达量计算。HTSeq-count利用基因区间的GTF（general transfer format）文件进行基因定位，需要读取SAM/BAM文件并按位置对reads进行分配和计数。
HTSeq-count对分配到多个基因的reads进行处理，对于这类reads，它将其计数分配到与之关联的基因的基础上，而不是等分计算。此外，HTSeq-count还支持stranded数据的读取和处理，可用于研究物种基因的转录本多样性以及转录水平的差异。
二、HTSeq-count的安装与使用
安装：HTSeq-count通常与Python 2.x版本使用。使用pip工具安装HTSeq-count，只需要在命令行中运行以下命令即可：
pip install HTSeq
使用：以下是使用HTSeq-count的一些基本步骤：
1. 准备SAM/BAM文件和GTF文件
htseq-count -f bam -r name -t exon -i gene_id accepted_hits.bam Homo_sapiens.GRCh38.99.gtf > counts.txt
其中，-f指定输入数据文件的格式，-r指定数据文件的id格式，-t和-i是GTF文件中特征和属性的名称。最后一项是输入文件和输出文件的名称。
2. 运行HTSeq-count脚本：
htseq-count -f bam -s yes -t exon -i gene_id aligments.bam genes.gff > counts.txt
在这个例子中，“-f”指定输入数据文件的格式为[BAM]，“-t”指定GFF文件中特征和“--stranded = yes”被设为stranded数据。
将读取的SAM/BAM文件与GTF/GFF文件相关联，使用Gene ID计数，输出计数表格并保存到文件中。
三、HTSeq-count的输出格式
HTSeq-count输出的文件包括每行一个基因和其对应的计数。输出的文件具有以下列：
- Gene ID：GTF文件中的基因ID
- 计数：read计数
默认情况下，HTSeq-count输出的结果没有标题行。如果您正在使用HTSeq-count的默认设置，不必添加标题，则结果将包括两列：
ENSG00000006534 128 ENSG00000006831 433 ENSG00000007062 1333
如果您需要一个标题，可以使用以下命令：
htseq-count -f bam -r name -t exon -i gene_id --stranded=yes --additional-attr=gene_name accepted_hits.bam Homo_sapiens.GRCh38.99.gtf | head -n 20 > counts.txt
此外，HTSeq-count支持添加基因名称和属性到结果中，并将它们用“\t”分隔。例如，要添加基因名称，使用“- -additional-attr=gene_name”选项：
ENSG00000089124 16 HLA-A ENSG00000134108 0 GHRL ENSG00000203997 2 RNU12-2P ENSG00000228527 0 HMGB1P1 ENSG00000236824 16 HLA-DRB5 ENSG00000186827 630 TRIM21 ENSG00000150337 0 CDKN2A-AS1 ENSG00000108455 207 C3
四、HTSeq-count的参数详解
HTSeq-count还有一些参数可以进一步定制其功能：
- f 格式
输入文件的格式，可以是SAM或BAM文件格式。
- s
可以是[yes/no/reverse]，指定read是否stranded
- t 特征类型
用于生成计数的特征类型，可以是exon/intron/CDS等。 例：-t exon。
- i 属性名
用作主要ID的属性。例如，如果GFF条目的第9列为“gene_id”，则可以通过使用-i gene_id选项将读数计数到这些ID中。
- m mode
（可选）特征的测量模式。模式可以是union / intersection-strict / intersection-nonempty。默认情况下，模式为"union"，即所有重叠的特征都计数。
- o 格式
输出文件格式, 例如BAM / SAM / BED / none / 'name sorted bed'等格式。
- n 每个read可计入的最大特征数
默认情况下，每个read只能可计入一次，但此参数用于在读取和特征之间建立多对多的关联关系。默认值为1。
五、HTSeq-count的优化和考虑事项
考虑到HTSeq-count读取、匹配和处理庞大的数据集以及高效处理各种单元格格式的需求，以下是一些优化和考虑事项：
1. 优化内存管理
使用内存映射技术Memorymapping，可以将文件读取到内存中，并允许从内存而不是硬盘驱动器中读取它们。这可以优化读取速度并降低访问文件的内存消耗。
2. 选择正确的算法
HTSeq-count使用的是Python语言，因此，可以选择一个适合特定任务的Python库来提高性能。例如， numpy 提供快速的数组运算和操作算法，pysam提供了对SAM / BAM随机读取器的更好支持。
3. 了解文件格式
在使用HTSeq-count时，最好了解数据文件的格式，以便为读取和处理准备好适当的选项。
六、总结
HTSeq-count是一个用于从SAM/BAM文件计算每个基因对应的读数的Python脚本，它使用GTF文件进行基因定位，并支持stranded数据的读取和处理。HTSeq-count的输出格式包括每行一个基因和其对应的计数，并且支持添加基因名称和属性到结果中。
优化HTSeq-count的内存管理，选择适合特定任务的Python库，了解文件格式等，能够提高其性能。熟练使用HTSeq-count需要深入了解其参数和使用方法，才能得到准确和高效的结果。
